研究背景

       缺血再灌注損傷是目前多種疾病如嚴重創傷、梗阻性冠狀動脈疾病救治中面臨的重要難題。以梗阻性冠狀動脈疾病所致心肌梗死為例，其目前唯一有效的治療方法仍然是及時識別心肌梗死范圍并再通。再灌注雖然可挽救心肌缺血損傷，但再灌注本身可進一步加重損傷。因此亟需開發同步快速識別梗死區域和保護受損心肌的一體化診療策略。

       線粒體是細胞中產生能量的細胞器，有氧呼吸的主要場所，也是細胞死亡調節的中心，同時還是現有心肌保護手段的關鍵靶點。開發以線粒體為靶點的心肌保護策略具有重要前景。既往研究表明，缺血再灌注損傷條件下，線粒體通透性轉換孔（mPTP）的持續性開放是導致細胞壞死的關鍵分子事件，因此基于靶向調控mPTP開放的治療策略成為目前心肌保護研究的重點方向。           

研究內容

       來自陸軍軍醫大學的史春夢教授團隊，在研究中發現了一種潛在的缺血選擇性藥物，可用于成像和保護心肌缺血再灌注損傷。相關工作發表在知名國際期刊Advanced Science上，標題為“Pharmaceutical Manipulation of Mitochondrial F0F1-ATP Synthase Enables Imaging and Protection of Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury Through Stress-induced Selective Enrichment”，文章第一作者為陸軍軍醫大學陳澤林副教授、譚旭副研究員和靳濤濤碩士研究生，通訊作者為陸軍軍醫大學史春夢教授。

       這種線粒體靶向小分子化合物IR-780，在心肌缺血再灌注損傷條件下，能在幾分鐘內快速識別缺血損傷的心肌危險區域。再灌注前預處理或及時給予IR-780均能有效減輕缺血和氧化應激誘導的細胞死亡和心力衰竭進而保護心臟功能。通過深入研究IR-780的保護作用機制，發現IR-780可與線粒體OXPHOS電子傳遞鏈的復合物V（又稱F0F1-ATP合酶）結合，快速降低線粒體膜電位，減緩線粒體的能量代謝，進而誘導線粒體進入“靜息狀態”。此外，IR-780還可以通過抑制線粒體鈣超載，來部分抑制mPTP的開放。研究結果表明：IR-780是一種心肌缺血再灌注損傷靶向診療一體化的候選小分子化合物，可為心血管疾病的靶向診療提供新的策略。

       本次研究中，作者基于瑞明生物的實時單細胞多功能分析儀，在單細胞水平上實時監測有無IR-780預處理的H9C2細胞給藥后的線粒體Ca2+濃度動態變化，實現了單細胞水平上藥物藥效的直觀且直接的驗證。結果顯示，IR-780預處理的H9C2細胞顯著降低了線粒體最大Ca2+濃度，并延遲了離子霉素處理后達到峰值的時間。           

研究圖文

圖一 IR-780可以識別I/R后發生梗死的危險區域。A)基于IR-780的成像方案示意圖。B)左：大鼠I/R模型再灌注2h后NIR成像的代表性圖像。右圖：TTC染色后同一組織對應的亮場照片。比例尺，5 mm。C)左：大鼠I/R模型再灌注48 h后全心NIR成像的代表性圖像。右圖：橫切面對應的NIR成像。比例尺，5 mm。D)是大鼠I/R模型再灌注48 h后損傷心臟組織的代表性共聚焦圖像。有危險的區域，IFA：有梗死的區域。比例尺，25 μm。

圖二 IR-780抑制mPTP活性，降低線粒體鈣含量。A)H9C2細胞暴露于假手術(0780（0.1或0.5 μm）、環孢素A（CsA，10 μm）、離子霉素（1或205μm）預處理后的線粒體膜電位試驗（TMRM染色）。B，C)環孢素A（CsA，10 μm）、離霉素（1 μm）預處理的H9C2細胞、IR-780（0.1或0.5 μm）的代表性共聚焦圖像(B)和定量流式細胞術數據(C)。比例尺，25 μm，每組n = 3。D，E) IR-780抑制mPTP活性。mPTP活性測定（線粒體鈣黃綠素下降斜率）(D)和線粒體鈣黃綠素(E)通過熒光監測暴露于離子霉素（1 μm）與pre-IR-780（0.1μm）（離子霉素給藥前15 min），每組n = 3。F)基于單細胞檢測H9C2細胞中4mt-GCamp6熒光示意圖。G，H)每個單細胞的4mt-GCamp6最大熒光值(G)和每個單細胞的4mt-GCamp6熒光監測線粒體Ca2+濃度(H)暴露于離子霉素（1 μm）有或沒有經過pre-IR-780（0.1 μm）處理（離子霉素給藥前15 min），每組n=5。  

技術簡介

實時單細胞多功能分析儀可以實時、連續、定量檢測單個活細胞的代謝類小分子含量及酶活性。單細胞研究對于理解細胞的組成、生理行為與功能的多樣性具有重要意義。基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組學等分析技術為單細胞研究提供了有力工具。

實時單細胞多功能分析儀 

主要性能：

1、實時多指標檢測：實時檢測單個活細胞內小分子含量（如葡萄糖、乳酸、ATP、膽固醇、Ca2+、K+等）

      及酶活性（葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、乳酸脫氫酶等），可匹配160余種商品化試劑盒；

2、亞細胞原位檢測：在亞細胞水平（胞質、胞核、胞膜）實現實時連續原位檢測；

3、超微量提取注射：單細胞水平提取細胞器（如溶酶體、線粒體）、胞質進行質譜或其它平臺的聯用分析；

      單細胞注射藥物、代謝劑等，并進行藥效或機制評價；

4、活體水平檢測：活體水平實時檢測生化指標（用藥前后、中醫針灸刺激前后）的變化。

線粒體研究應用再拓展

       線粒體的功能狀態與線粒體膜電位、線粒體膜通道、線粒體Ca2+濃度、ATP生成、呼吸鏈復合體活性、活性氧生成以及DNA突變密切相關。線粒體與其他細胞器的相互作用可以調節細胞的命運和功能（線粒體-內質網接觸調節鈣信號、氧化還原信號、線粒體動力學和質量控制、脂代謝和未折疊蛋白反應；線粒體-溶酶體的接觸調節線粒體和溶酶體的動力學和鈣信號）。基于實時單細胞多功能分析儀可實現ROS、Ca2+、線粒體超氧化物、線粒體膜電位、線粒體膜通透性轉換孔（mPTP）、細胞衰老β-半乳糖苷酶檢測、ATP、谷胱甘肽、丙酮酸、乳酸、乳酸脫氫酶、細胞色素C等相關指標的檢測，為線粒體的研究提供單細胞及亞細胞維度上的數據支撐。同時基于該設備的超微量提取注射功能，可實現單細胞線粒體、溶酶體提取，并結合測序、PCR或質譜等技術進行下游分析，獲取更為精準的數據結果。

文獻詳情

Pharmaceutical Manipulation of Mitochondrial F0F1-ATP Synthase Enables Imaging and Protection of Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury Through Stress-induced Selective Enrichment

Zelin Chen, Xu Tan, Taotao Jin, Yu Wang, Linyong Dai, Gufang Shen, Can Zhang, Langfan Qu, Lei Long, Chongxing Shen, Xiaohui Cao, Jianwu Wang, Huijuan Li, Xiaofeng Yue, and Chunmeng Shi*

Advanced Science

DOI: 10.1002/advs.202307880